In-Vitro-Analysen

Für viele Untersuchungen, die an Probanden nicht möglich sind, gewinnen In-vitro-Testverfahren mehr und mehr an Bedeutung.

Für kosmetische Produkte, die oft über einen langen Zeitraum verwendet werden, ist eine dermatologische Testung auf Unbedenklichkeit eine essentielle Voraussetzung für hohe Anwendungssicherheit und Kundenzufriedenheit. Durch die Bestimmung und Bewertung verlässlicher und reproduzierbarer biologischer Endpunkte anhand histologischer und biochemischer Analysen kann eine Aussage über die Einflüsse eines Produktes auf regenerative biologische Prozesse der Haut getroffen werden.

Das 3D Hautmodell eignet sich in besonderer Weise für eine solche Untersuchung, da es die natürliche histologische Abfolge epidermaler Zellschichten und dermaler Strukturen ausbildet, wie sie von menschlicher Epidermis bekannt ist. So liegt das Stratum basale, die basale Keratinozytenschicht, direkt auf einem belebten Dermis-Equivalent (Fibroblasten) auf und wird histologisch von dem Stratum spinosum und dem Stratum granulosum gefolgt, welche gewebeabschließend von den Hornzellschichten des Stratum corneum überdeckt werden.
Störungen der regulären epidermalen Verhornung (Orthokeratose), verursacht durch diverse Reizeinflüsse physikalischer (mechanisch, UV-A/B) oder chemischer (SLS) Natur, können quantitativ und qualitativ analysiert und bewertet werden.

In den In-vitro Studien untersuchen wir:

  • Integrität der Hautbarriere/ Regeneration nach Schädigung,
  • UVA/B Schäden,
  • Produktverträglichkeit.

Wir begutachten:

  • epidermale Differenzierung,
  • Hautbarriere relevanter Strukturen,
  • Vitalität,
  • Integrität der Dermo-Epidermalen Zone (DEJ),

Wir analysieren:

  • Morphologisch- histologische Strukturen nach speziellen Anfärbungen,
  • Immunfluoreszenzfärbungen von Proteinen, die an der Differenzierung der Korneozyten beteiligt sind,
  • Quantifizierung von Interleukinen (z.B. IL-1α, Il-6) durch Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA),
  • weitere Methoden in der Entwicklung.

Histologische Analyse

Histologie ist die Wissenschaft von biologischen Geweben (histos = Gewebe & Logos = Lehre). Mit Hilfe der Histologie können feingeweblich-morphologische Veränderungen auf zellulärer Ebene durch spezifische Färbungen sichtbar gemacht und entsprechend begutachtet werden. Die gängigste Färbung der Histologie und Histopathologie ist die H&E Färbung. Hierbei werden Nukleinsäuren intensiv dunkelblau, Zytoplasma sowie Bindegewebe rosa-rot angefärbt. Die unten stehende Abbildung zeigt eine H&E Färbung eines gesunden Modells (A) sowie eines UVB-exponierten, geschädigten Models (B).

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Hämatoxilin und Eosin (H&E) Färbung eines Ultradünnschnittes A) unbehandeltes Modell B) UVB-bestrahltes Modell (250 mJ/cm2) nach 48 h. geschlossene Pfeile: Sonnenbrandzellen (sun burned cells); offene Pfeile hydropische Zellen (massive Flüssigkeitsansammlung). *: typische Dyskeratose (Verhornungsstörung) nach UV Exposition.

Das Modell weist alle physiologischen Schichten (stratum basale, spinosum, granulosum und corneum) nativer menschlicher Haut sowie eine regelrechte Verhornung auf (A). Abbildung B zeigt ein Modell  48 h nach UVB-Exposition (250 mJ/cm2).
Deutlich erkennbar sind die typischen Merkmale einen Sonnenbrandes. Zahlreiche sogenannte „sun burned cells“ (geschlossener Pfeil), hydropische Zellen, welche vermehrt Flüssigkeit beinhalten und einen weniger stark gefärbten Zellkern aufweisen (offene Pfeile), sowie die typische Verhornungsstörung (Dyskeratose).
Zusätzlich sind vereinzelt vakuolisierte Keratinozyten zu sehen. Anhand dieses Modells kann die Schutzfunktion (Sonnenschutz) und/oder das regenerative Potential einer Formulierung oder einzelner Substanzen auf zellulärer Ebene untersucht und bewertet werden.

Analyse der Zellteilungsrate

Die Zellteilungsrate (Proliferation) ist ein wichtiger Indikator für die Vitalität oder „Fitness“ eines Gewebes. In der menschlichen Epidermis sind nur die Keratinozyten des stratum basale (Basalkeratinozyten) zur Zellteilung befähigt. Diese kompensieren die durch den permanenten Vorgang der Abschilferung verloren gegangenen Korneozyten, sorgen somit für die Homöostase des Gewebes und verhindern eine zelluläre Ausdünnung der Epidermis.

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Ultradünnschnitt eines Vollhautmodells. A) Hellfeldaufnahme B) Fluoreszenzaufnahme. Blau =  Zellkerne, Rot: sich teilende Zellen.

Mittels der Click-It EdU® Technologie können die Basalkeratinozyten der Epidermis und die Fibroblasten der Dermis während der Zellteilung (Mitose) im Hautmodell spezifisch markiert werden (A + B). Anhand dessen lässt sich feststellen, ob eine Substanz oder Formulierung nach definierter topischer oder systemischer Applikation und Behandlungszeit das Zellteilungsverhalten beeinflusst.
Das Mitführen einer unbehandelten Kontrolle ermöglicht die prozentuale Quantifizierung der Zellteilungsrate. Beispiele erhöhter Zellteilungsaktivität: Wundheilung, Entzündungsprozesse.

Integrität der Hautbarriere

Ein weiterer wichtiger Parameter für eine gesunde Haut ist eine intakte Hautbarriere, die zum einen den übermäßigen Wasserverlust verhindert, zum anderen eine effektives Schutzschild gegen Pathogene, Umwelteinflüsse und (chemische) Noxen darstellt.

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Ultradünnschnitt eines Vollhautmodells. A) Behandlung mit sterilem PBS B) 45 minütige Behandlung mit 1 % SDS.
Blau = Zellkerne, Grün: Lucifer Yellow Färbung.


Einzelne Substanzen, komplette Formulierungen oder chemische Noxen können die Integrität der Hautbarriere beeinflussen. Dadurch kann es zu erhöhtem Wasserverlust (erhöhte Evaporation) sowie der Aufnahme schädlicher Agenzien aus der Umwelt kommen, die (passiv) in die Haut gelangen. Im Vollhautmodell kann mittels der dargestellten Lucifer Yellow Färbung untersucht werden, ob ein Produkt die Hautbarriere beeinflusst. Steriles Wasser oder PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) haben keinen Einfluss auf die Intaktheit der Barriere (A). Der topisch applizierte Farbstoff verbleibt komplett in den obersten Hautschichten (Stratum corneum).
Eine 45 minütige Behandlung mit dem Tensid SDS (1%) führt hingegen zu einer Beschädigung der Hautbarriere (B). Der Farbstoff dringt in die tieferen Hautschichten (Dermis) vor. Mit Hilfe dieser Methode kann ausserdem untersucht werden, ob ein Produkt die Barrierefunktion nach einer Schädigung wiederherstellen kann.

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